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科西莫一世的继任者弗朗切斯科一世·德·美第奇开始将家族收藏存放至宫殿的顶层，并不断的扩充，是欧洲最古老的博物馆之一。至斐迪南二世·德·美第奇大公时期收藏达到顶峰，斐迪南二世的妻子维多利亚·德拉罗维雷是末代乌尔比诺公爵弗朗切斯科·玛丽亚二世·德拉·罗维雷的唯一继承者，藉著这段婚姻，他获得了蒙特费尔特罗家族及德拉·罗维雷家族部分的收藏，而大公的两位枢机弟弟吉安卡洛·德·美第奇以及列奥波尔多·德·美第奇也对扩充家族收藏不遗余力，尤其是列奥波尔多，美术馆的画作中有十分之一是由他收藏的。科西莫三世·德·美第奇大公以收藏古雕像及法兰德斯绘画闻名，而美第奇家族最后的统治者吉安·加斯托内·德·美第奇也持续妆点这座美术馆。
美第奇家族在1737年绝嗣，公国继承权原本要交给西班牙波旁王朝的卡洛斯三世，但后来又转交给洛林家族的法兰兹一世，两者皆与美第奇家族有血缘关系。末代大公吉安·加斯托内·德·美第奇的姐姐普法尔茨选帝侯夫人安娜·玛丽亚·路易萨·德·美第奇在与洛林家族签订艺术品遗产移交协定时确立了一些硬性条款，她规定这些艺术品必须留在佛罗伦斯不可携出，且必须为公众服务，如此具有前瞻性的条款可谓前所未有，她试图传达艺术遗产是一笔国家财富而非属统治者的财产，也因为如此乌菲兹美术馆的收藏在历经数个世纪能保存得如此完整。
1762年夏天，美术馆经历了一场火灾，幸好火势很快被扑灭，没有造成多大的损失，重新整修的美术馆随后于1765年正式对公众开放。
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