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巴比妥类药物的钠盐可与硝酸银反应，先生成可溶的一银盐。若硝酸银过量，则生成难溶的二银盐白色沉淀。巴比妥类药物在吡啶溶液中生成的烯醇式异构体可与铜吡啶试剂反应，生成稳定的配位化合物。一般的巴比妥类药物出现紫堇色或紫色沉淀，含硫巴比妥类药物则出现绿色沉淀。在pH值较高的溶液中，在三氯甲烷中，该沉淀的溶解度随着5,5取代基亲脂性的增加而增大。巴比妥类药物在碱性溶液中可与钴离子生存紫堇色配位化合物。巴比妥类药物可与硝酸汞或氯化汞反应生成白色沉淀。该沉淀能溶于氨水中。
巴比妥类药物六元环中的丙二酰脲基团中氢可与香草醛在浓硫酸的催化下发生缩合反应显棕红色。《英国药典》2005年版即采用该原理鉴别戊巴比妥。
巴比妥类药物的电离会引起共轭体系延长，所以电离极数的不同会影响其紫外吸收光谱。5,5二取代巴比妥类药物可发生二级电离，1,5,5三取代巴比妥类药物则只发生一级电离。因此，在酸性溶液中，二取代和三取代巴比妥类药物不电离，无明显吸收峰；在pH为10的溶液中，两者都发生一级电离，最大吸收峰位于240nm处；在pH为13的溶液中，二取代巴比妥类药物发生二级电离，所以其最大吸收峰红移至255nm处。
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