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293T细胞系最初在斯坦福大学Michele Calos的实验室中制造，是一种稳定转染了编码SV40大T抗原温度敏感型突变体质粒的HEK 293细胞，最初被称为293/tsA1609neo。其在文献中第一次被称为“293T”，是在被用于开发生产逆转录病毒颗粒的BOSC23细胞系时。

在制造293T细胞时转染的pRSV-1609质粒使得它具有新霉素/G418抗性，并且可以表达SV40大T抗原的tsA1609突变体。这种突变的基因在33℃时具有完全的活性，在37℃时也具有相当的活性，但是在40℃时失活。和它的原型293细胞一样，293T细胞在用DNA转染时效率很高。而且由于SV40大T抗原的表达，携带SV40复制原点的质粒可以在293T细胞中复制，并且在短时间内保持较高的拷贝数，使得其表达重组蛋白或病毒的量大大增加。

对3个独立的293T分离株细胞系都已经进行了全基因组测序，它们彼此之间是相似的，不过和原来HEK 293细胞系的基因组都已经有可检测的差别。

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