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优选的天然切割序列首先通过检查天然多蛋白底物中的切割位点的重复序列来鉴定。这些天然切割位点的共识是ENLYFQ\S，其中“\”表示切割的肽键。底物的残留物在切割位点之前标记为P6到P1，在切割位点之后标记为P1'。早期的工作还测量了一系列相似底物的切割，以表征蛋白酶对天然序列的特异性。
随后的研究使用从随机序列池中切割底物的测序来确定偏好模式。尽管ENLYFQ\S是最佳序列，但蛋白酶在一系列底物上或多或少都有活性（即显示出一些底物混杂）。最高切割是最接近共有EXLYΦQ\φ的序列，其中X是任何残基，Φ是任何大或中等疏水基，φ是任何小的疏水或极性残基。虽然这个序列是最优的，但如果序列的其余部分是最优的，那么在某些位置具有不利残基的序列仍然可以被切割。
酶和底物之间的大接触面积赋予了特异性。由于只有一个或两个口袋结合底物侧链的浅结合裂口，蛋白酶（如胰蛋白酶）对断裂键前后的一个残基具有特异性。相反，病毒蛋白酶（如TEV蛋白酶）有一个长的C端，它完全覆盖底物以形成结合隧道。该隧道包含一组紧密的结合口袋，这样底物肽的每个侧链（P6到P1'）都结合在一个互补位点（S6到S1'）。
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