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另外，负氧离子孔也可以促进底物的进入与稳定。如果底物没有到达反应位点，负氧离子孔就找不到可供稳定化的目标，从而产生空阻直到底物到位（例如血红蛋白中的BPG）。

催化多步反应的酶可以具有多个负氧离子洞，以稳定反应中的不同过渡态。

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